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成像常见问题

活体成像的7个常见问题

1. 关于小动物活体成像技术的起源与发展

活体动物体内光学成像主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP, Cy5及Cy7等)进行标记。

该技术最初是由美国斯坦福大学的科学家采用了世界上最优秀的高性能CCD研发与生产制造商最新研发的背部薄化、背照射冷CCD,配合密闭性非常好的暗箱,使得直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为成为现实。科学家借此可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。所以说该技术是伴随着背部薄化、背照射冷CCD的产生而产生,并随着该CCD技术的发展而发展。由于具有更高量子效率CCD的问世,使活体动物体内光学成像技术具有越来越高的灵敏度,对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高。

在该技术诞生后的5、6年间,科学家借此取得了大量的科学成果,发表了几百篇文献资料,大部分都是应用以背部薄化、背照射冷CCD为核心部件的成像系统而得出的。活体动物光学成像技术的应用史,就是生物学家应用背部薄化、背照射冷CCD进行生物微弱发光检测的应用史。没有背部薄化、背照射冷CCD,就没有活体动物光学成像技术的诞生和发展。背部薄化、背照射冷CCD之所以促进活体动物光学成像技术的发展,主要是由于超低温的CCD芯片,CCD镜头温度越低,噪音越小,信噪比越好,灵敏度越高。正是由于背部薄化、背照射冷CCD对动物微弱发光的极高的灵敏度,才使得该项技术得到广泛的应用。由于卓越的背照射冷CCD技术的问世,科学家利用此技术进行了大量的研究,才使近年来产生了大量的高水平的应用活体成像技术进行肿瘤学、基因治疗、流行病学等研究的文献,极大的促进了生物医学在分子成像方面的发展。

2. 科学家在活体成像技术诞生之初是如何进行CCD的选择的?

诚实的讲,斯坦福的科学家在这方面进行了很多探索和尝试,他们在2000年-2001年仪器研发之初写过很多文献,探讨这些问题。是关于仪器的设计的。那时科学发展的必经之路。我觉得那些探索和尝试是有说服力的,是科学的态度和精神,抓住了问题的本质。在该技术诞生之初,科学家就对此进行的探索,见如下文献:In vivo imaging of light-emitting probes Journal of Biomedical Optics 6(4), 432–440 October 2001 文中详细描述了活体动物光学成像技术对CCD的特殊要求,见下面的文字:

活体动物光学成像技术对CCD的特殊要求体

文中详细描述了应用在活体成像实验中的CCD的性能要求:背部薄化、背照射冷CCD。并指出了背部薄化、背照射冷CCD是用于活体成像技术的最合适的CCD的选择。活体生物发光成像技术随着背部薄化、背照射冷CCD技术的产生而产生,并随着该CCD技术的发展而发展。背照射、背部薄化冷CCD是经过探索得出的结论,灵敏度是最本质的需要,有过很多比较和尝试,最后才形成共识。

3. 关于CCD的“背部薄化、背照射”与“冷”的确切含义是什么?

之所以叫冷CCD,是由于CCD的芯片温度下降到零下20℃或110℃,可以降低噪音,提高检测的灵敏度。JPLY的制冷技术可以使CCD的温度达到-20℃,那样的温度可以使背照射冷CCD的暗电流减少到可忽略不计的水平。该CCD的2erms的电子噪音代表了最小的噪音底线,信号强度肯定会大于那样的噪音水平,使该CCD具有很高的信噪比,检测的特异性很强。

关于CCD的前照射与背照射的问题。前照射CCD,在光信号到达CCD芯片之间的光路上有多硅层和二氧化硅层,那将减少CCD的量子效率,造成光信号的衰减,降低灵敏度。背照射、背部薄化CCD则是在光信号到达CCD芯片之间的光路上去掉了多硅层和二氧化硅层,那大大提高了检测的效率,但是同时极大的增加了生产的成本。所以活体光学成像系统才有那令人费解的高昂的价格。但对于较强的荧光信号来说,不需要很灵敏的CCD就可以检测到,多硅层和二氧化硅层还可以起到保护芯片的作用。所以一般单纯检测荧光,一般用前照射的CCD,检测生物发光和荧光,则建议用背照射的CCD。在体外实验中,一般都是用前照射的CCD,可以说在生物学的大部分实验中所使用的都是前照射的CCD,背照射的CCD,只有在检测非常微弱的生发光信号时才有用武之地。下图是前照射CCD与背照射的CCD原理结构图。

前照射CCD与背照射的CCD原理结构图

4. 如何判断活体光学成像仪器的性能优劣?

活体生物发光成像技术最初是由美国斯坦福大学的科学家采用了最新研发的背部薄化、背照射冷CCD,配合密闭性非常好的暗箱,使得直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为成为现实。之所以要求冷CCD,是因为降低温度可以降低暗电流和电子噪音,使背景噪音可以达到几乎忽略不计的水平;之所以要求背部薄化,是为了减少光源与CCD感光芯片之间的光路介质,提高量子效率,最大限度的捕捉光信号。活体生物发光成像系统的核心参数是CCD的温度、量子效率,其他的参数都是围绕这些参数而衍生出来的。所有的参数的优化都是为了实现一个目的:提高灵敏度,提高信噪比。CCD温度越低,暗电流和电子噪音越低,导致噪音越低,从而能够检测的最低信号越低。量子效率代表检测光子的效率,一般检测生物发光的CCD量子效率要求至少在检测波段是85%以上。以背部薄化、背照射冷CCD为核心组成的系统是唯一适合进行活体生物发光检测的仪器。

5. 关于细胞标记等生物学服务的问题

通过两年多不懈的努力和大家的支持,活体动物光学成像技术终于获得了广泛的认同。为促进该技术更接近大家的科研实践,为中国的生物医学研究贡献一份力量,我们构建了进行活体成像实验的服务模式,方便已经购买相关仪器的和没有相关仪器的科研人员都能够进行相关的实验。服务包括用荧光素酶标记肿瘤细胞、病毒和动物;荧光标记小分子药物;优惠的底物荧光素;相关的实验方法、实验设计和实验操作指导;并可应用相关仪器进行有偿检测。关于细胞标记,有pGL3 、慢病毒、逆转录载体三种标记细胞的方法。具体细节请与我们联系。

6. 哪些荧光素酶基因标记的细胞可以购买?

我们已经标记了“A-549(肺癌细胞),Lncap(前列腺癌细胞)”等细胞,可以对外销售,而且价格比进口的优惠,并且供货方便。我们正在扩大我们的标记细胞的数量,欢迎与我们联系,具体磋商。另外,我们也有β-actin启动子驱动GFP的转基因小鼠提供。

7. 该技术适合进行小分子药物活体示踪吗?

关于活体成像系统常见问题解答不适合。由于荧光标记检测的灵敏度,以及荧光检测的深度等限制,活体光学成像不是很适合进行小分析药物活体示踪的实验。核素标记的PET和SPECT技术由于检测的深度、灵敏度以及标记的原因是适合进行小分析药物活体示踪实验的技术,该领域是一个正在蓬勃发展的领域,但是由于GE、西门子等公司的相关产品价格昂贵,很难满足大多数科研工作者的需要,所以一时间该技术没有得到普及和应用。但是国外有一些公司正在开发价格适中的产品,不久就会进入中国市场,将使中国的科研工作者应用该技术进行小分子药物的吸收、分布、代谢、分泌等研究变的方便起来。该技术可以实现三维成像,详细了解标记物的位置。应用该技术进行骨骼代谢的例子见右图:

 

 

 

 

 

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